Взаимодействие неаллельных генов. Плазмидное наследование

Взаимодействие неаллельных генов

1. Комплементарность – тип взаимодействия неаллельных генов, при котором доминантные гены из разных аллельных пар сочетаясь вместе в генотипе обеспечивают появление нового признака (поэтому генотип А-В- всегда имеет новый фенотип).

2. Эпистаз — тип взаимодействия неаллельных генов, при котором гены одной аллельной пары подавляют действие генов другой аллельной пары. Различают доминантный и рецессивный эпистаз.

3. Полимерия — тип взаимодействия неаллельных генов, при котором гены из разных аллельных пар отвечают за одно выражение признака. При этом они обозначаются одинаковыми буквами, но с разными индексами: А1А1А2А2; а1а1а2а2.

При кумулятивной полимерии степень выраженности признака зависит от числа доминантных генов в генотипе: чем больше доминантных генов, тем признак более выражен.

При некумулятивной полимерии наличие хотя бы одного доминантного гена из любой пары обеспечивает сразу максимальное выражение признака.

Аутосомное наследование – это наследование признаков, за развитие которых отвечают гены, расположенные не в половых хромосомах (аутосомах). Аутосомное наследование может проходить по доминантному и рецессивному типу.

Наследование, сцепленное с полом

Наследование, сцепленное с полом — наследование признаков, за развитие которых отвечают гены, расположенные в половых хромосомах.

Пол, несущий одинаковые половые хромосомы (ХХ), называется гомогаметным и образует один тип гамет.

Пол, несущий разные половые хромосомы (ХУ), называется гетерогаметным и образует 2 типа гамет.

При наследовании, сцепленным с Х-хромосомой, гомогаметный пол может быть представлен гомозиготой (доминантной — Х А Х А или рецессивной — Х а Х а ) или гетерозиготой — Х А Х а . Гетерогаметный пол всегда представлен гемизиготой — Х А У или Х а У

У некоторых организмов (например, млекопитающие) гомогаметный пол — женский, у других организмов (например, бабочки, птицы) гомогаметный пол мужской.

При наследовании, сцепленным с У-хромосомой, признак передается только по линии гетерогаметного пола. Такое наследование называется голандрическим.

Генетика пола

·У некотрых организмов пол определяется составом половых хромосом: у млекопитающих гомогаметный пол — женский, у других организмов (например, бабочки, птицы) гомогаметный пол мужской.

·У некоторых организмов пол определяется числом половых хромосом. Например, у кузнечиков самки — ХХ, а самцы — Х0.

·У дрозофилы наследование пола зависит не столько от числа Х-хромосом, сколько от соотношения числа Х-хромосом к числу наборов аутосом. Такое отношение называют половым индексом. Для генотипа ХХ: 2Х:2А=1, половой индекс равен 1, то развивается самка. Для генотипа ХУ: 1Х:2А=0,5 — развивается самец. При промежуточном соотношении развиваются интерсексы (2Х:3А=0,67), то есть мухи, имеющие промежуточный фенотип.

·У некоторых организмов (пчел, муравьев, ос) существует гапло-диплоидный тип определения пола. У этих особей нет половых хромосом. Самки развиваются из оплодотворенных яиц, а самцы из неоплодотворенных.

·У некоторых организмов в определении пола большую роль играет внешняя среда.

Хромосомная теория наследственности

В 1908-1911 гг. американским генетиком Т.Морганом был установлен ряд закономерностей наследования, получивший впоследствии названиехромосомной теории наследственности.

Основными положениями этой теории являются следующие:

1) гены расположены в хромосомах, представляющих собой группу сцепления генов; число групп сцепления генов равно гаплоидному набору хромосом, специфическому для каждого вида организмов;

2) гены расположены в пределах хромосомы линейно; место, занимаемое геном в хромосоме, называется «локус».

3) сцепление генов может нарушаться в результате кроссинговера (перекреста хромосом), в ходе которого гомологичные хромосомы обмениваются между собой одним или несколькими генами;

4) частота обмена генами (частота кроссинговера) пропорциональна расстоянию между генами в пределах хромосомы.

Изучение частоты (процента) кроссинговера между генами, локализованными в пределах одной хромосомы, позволяет установить относительное расстояние между ними, оцениваемое в единицах морганидах (1 морганида равна расстоянию между генами с частотой кроссинговера в 1%). На основе многочисленных экспериментов по изучению кроссинговера составляются генетические карты хромосом. В настоящее время они составлены для всех хромосом мухи-дрозофилы, отдельных хромосом томатов, кукурузы и других видов.

Биологическая роль хромосом

Хромосомы во взаимодействии с внехромосомными элементами клетки обеспечивают:

1) хранение генетической наследственной информации;

2) использование генетической информации для создания и поддержания клеточной организации;

3) регуляцию «считывания» генетической информации;

4) удвоение генетического материала;

5) перекомбинирование генетического материала в процессе мейоза;

6) передачу генетического материала от материнской клетки дочерним.

Сцепленное наследование – наследование признаков, за которые отвечают гены, расположенные в одной хромосоме.

Изучал Т. Морган. При скрещивании дигетерозиготных самок дрозофил (АаВв), имеющих серое тело и нормальные крылья (доминантные признаки) с самцами дрозофил (аавв), имеющими черное тело и укороченные крылья (рецессивные признаки) в потомстве по законам Менделя ожидалось расщепление по фенотипу и генотипу как в анализирующем скрещивании 1:1:1:1. Однако Морганом было получено расщепление:

— 41,5% — с серым телом, нормальными крыльями;

— 41,5% — с черным телом, укороченными крыльями;

— 8, 5% — с серым телом, укороченными крыльями;

— 8,5% — с черным телом, нормальными крыльями.

Морган делает вывод, что гены, отвечающие за окраску тела и длину крыльев, расположены в одной хромосоме и поэтому наследуются сцеплено. Наличие фенотипических групп, отличных от родительского организма, является результатом кроссинговера.

Сцепление генов может быть полным или частичным.

При полном сцеплении кроссинговер между генами по каким-либо причинам невозможен, или гены настолько близко расположены друг к другу, что вероятность кроссинговера между ними настолько мала, что им можно пренебречь.

Например, и дигетерозиготных самцов дрозофил, имеющих серое тело и крылья нормальной длины кроссинговер не возможен из-за отсутствия фермента, обеспечивающего конъюгацию хромосом.

При частичном сцеплении между генами возможен кроссинговер, и необходимо учитывать процент образования кроссоверных гамет.

Особенности взаимосвязи
между генотипом и фенотипом

Генотипом называется совокупность всех генов данного организма. Фенотип — это совокупность всех внешних и внутренних признаков организма. Между генотипом и фенотипом существуют следующие взаимосвязи (взаимоотношения).

1. Ген контролирует (кодирует) структуру белка одного вида, обладающего, чаще всего, ферментативной активностью. Регулируя биосинтез белков или другие важные биохимические превращения, фермент оказывает влияние на проявление того или иного признака и, тем самым, на формирование или изменение фенотипа организма.

2. Однако проявление действия генов и характер возникающего признака зависят от условий окружающей среды. Условия среды воздействуют на особенности протекания и скорость биохимических реакций и, тем самым, оказывают влияние на фенотипический признак или степень его выраженности. Таким образом, в определенных пределах (пределах нормы реакции) может происходить изменение фенотипа без предварительного изменения генотипа. Это явление получило название модификационной (фенотипической) изменчивости. Пределы таких независимых изменений фенотипа, тем не менее, контролируются генотипом.

3. Изменения фенотипа, обеспечивающие адаптацию организма к конкретным условиям среды, происходящие независимо от генотипа, не наследуются потомством, и, казалось бы, не имеют эволюционного значения. Однако, любые адаптации организма (изменения фенотипа), повышающие уровень его приспособленности к окружающей среде, повышают, тем самым, и его шансы на репродуктивный успех. В таком случае генотипы этих организмов скорее сохранятся в эволюционной линии (цепочке последующих поколений), чем будут устранены из нее. Следовательно, отдельные ненаследуемые (фенотипические) изменения обеспечивают выживание организмов (генотипов) – обладателей аллелей (генов), контролирующих другие адаптивные признаки, информация о которых наследуется потомством и примет дальнейшее участие в эволюции.

Ген как единица наследственности

Согласно современным представлениям, ген — это участок молекулы ДНК, кодирующий иРНК (а, следовательно, первичную структуру белка), или тРНК, или рРНК.

Вся совокупность генов составляет генотип организма.

1. Способность к самоудвоению.

2. Способность мутировать независимо от остальных генов, дискретно изменяя своё внутреннее состояние как целое, т.е. порождая аллели.

3. Способность к гомологичному синапсису при коньюгации в мейозе.

4. Неделимость и несмешиваемость в процессах коньюгации и кроссинговера.

5. Устойчивость локализации в геноме относительно других генов.

6. Способность контролировать развитие некоторого признака или небольшого их числа, что отражено в названиях генов.

7. Высокая устойчивость к мутациям и другим изменениям.

1. Структурные гены контролируют развитие конкретных признаков. Каждый ген контролирует синтез фермента, регулирующего определённый этап метаболизма.

2. Гены-модуляторы смещают в ту или другую сторону процесс развития признака, кодируемого структурным геном (цистроном).

а) гены-ингибиторы могут тормозить развитие отдельных признаков, обусловливаемых плейотропным действием структурных генов, или даже целиком подавлять функции других генов

б) гены-интенсификаторы усиливают функцию цистронов

в) гены-модификаторы оказывают влияние на степень проявления признака, обусловливаемого расположенным в другом локусе структурным геном.

3. Гены-регуляторы координируют активность генов, регулируя «вклю­чение-выключение функции» различных генов во времени в процессе онтогенеза.

Генотип как целостная исторически сложившаяся система взаимодействующих клеток

Генотип формируют все (ядерные и внеядерные) гены данного организма. Несмотря на то, что гены локализованы в различных самостоятельных структурах (хромосомы, кольцевые молекулы ДНК митохондрий и пластид) все они взаимосвязаны и могут взаимодействовать друг с другом в процессе развития организма (формирования фенотипа). Поэтому вся совокупность генов организма представляет собой взаимодействующую систему организма – генотип.

Как любая система, генотип характеризуется целостностью и единством: повреждение (устранение) даже одного гена нарушает свойства всей системы, что может проявиться в резком снижении жизнеспособности или даже гибели организма. Генотип формируется в ходе эволюции, в процессе которой структура генов изменяется. Поэтому генотип рассматриваетсякак результат процесса эволюции, или исторически сложившаяся система взаимодействующих генов.

Различают аллельные и неаллельные взаимодействия генов.

Составляющие генотип гены могут обладать различными свойствами:

· структурные гены кодируют структуру молекулы и-РНК (а в конечном итоге структуру белковой молекулы одного вида), транспортной или рибосомной РНК (т-РНК, р-РНК);

· гены-регуляторы осуществляют активизацию или угнетение активности структурных генов, за счет синтеза белка-репрессора;

· ген-промотор обеспечивает инициацию процесса транскрипции (синтеза и-РНК), это место прикрепления РНК-полимеразы.;

· ген-оператор включает в работу или выключает из нее структурный ген. Если ген-оператор заблокирован белком репрессором, то транскрипция со структурных генов не происходит. Если ген оператор свободен от белка репрессора, РНК-полимераза может вести транскрипцию со структурных генов.

Регуляция активности генов на уровне транскрипции (на примере лактозного оперона)

Единицей транскрипции является транскриптон, или оперон (термин «оперон» введён Ф. Жакобом и Ж. Моно в 1961 году). Оперон — это участок ДНК, транскрипция которого приводит к образованию молекулы иРНК. Структура оперона изучена подробно пока только у прокариот. Оперон может состоять из одного, двух и более тесно сцепленных структурных генов, кодирующих белки (ферменты), а также регуляторных элементов. Участком начала транскрипции является промотор, состоящий из нескольких десятков нуклеотидов ДНК, с которым специфически связывается осуществляющий транскрипцию фермент РНК-полимераза. От промотора зависит, к какой из двух цепей ДНК присоединится РНК-полимераза и начнётся транскрипция. Транскрипция происходит только на одной («лидирующей») цепочке ДНК, и химическая структура промотора определяет эту цепь.

В состав оперона входит также ген-оператор длиной в несколько десятков нуклеотидов, с которым связывается репрессор (специфический белок), обусловливающий отрицательную регуляцию: в этом случае ДНК-полимераза не может перемещаться вдоль оперона и транскрипция структурных генов не происходит. Если же оператор не связан с репрессором, то РНК-полимераза, смещаясь вдоль структурных генов (цистронов), транскрибирует их.

Репрессор, контролирующий транскрипцию оперона, кодируется геном-регулятором, который не обязательно входит в состав оперона: он может находиться за пределами оперона этой же хромосомы или в иной хромосоме. Один репрессор может контролировать транскрипцию нескольких оперонов. Молекула репрессора имеет участок узнавания эффектора, который активирует, или, наоборот, инактивирует репрессор, связываясь с ним. Оперон заканчивается терминатором, представляющим собой один из трёх триплетов, не кодирующих аминокислоты (УАА, УАГ, УГА). Синтезируемая сразу на нескольких цистронах общая цепочка РНК распадается на фрагменты — иРНК, соответствующие каждому отдельно взятому цистрону.

Смотрите еще:  Требования пнаэ. Требования пнаэ

Включение оперона происходит при проникновении в цитоплазму субстрата (например, лактозы), для химического превращения которого требуется соответствующий фермент. Субстрат, соединяясь с репрессором, лишает последний возможности блокировать ген-оператор. Тогда происходит транскрипция структурного гена и синтезируется необходимый белок. Фермент вызывает вовлечение субстрата в процессы клеточного метаболизма. В ходе последнего количество субстрата уменьшается, что приводит к высвобождению репрессора, блокированию оператора и прекращению транскрипции.

Основные структуры оперона (транскриптона) и процессы, участвующие в регуляции белкового синтеза согласно гипотезе Жакоба-Моно (цифры указывают последовательность событий)

Индукция синтеза ?-галактозидазы согласно гипотезе Жакоба-Моно (цифры указывают последовательность событий)

Изменчивость – способность организма приобретать новые признаки в процессе индивидуального развития.

Различают: 1) наследственную изменчивость (генотипическую): мутационную и комбинативную; 2) ненаследственную изменчивость (фенотипическую) – модификационную.

Модификационная изменчивость – изменчивость, затрагивающая только фенотип и не затрагивающая генотип.

1. Не наследуется (так как не затрагивает генотип).

2. Носит групповой характер — сходные изменения возникают у группы особей.

3. Предсказуема – результат действия фактора можно предсказать.

4. Направлена – изменения, возникающие под действием фактора, часто носят адаптивный характер.

5. Обратима – возникающие изменения могут быть обратимы. Однако если действие фактора не специфично или он действует в критический период развития, то могут возникать необратимые изменения – морфозы.

6. Границы изменчивости признака называются нормой реакции и определяются генотипом.

Модификационную изменчивость изучают с помощью вариационно-статистического метода. При этом конкретные значения признака – варианты – размещают в порядке возрастания значений, образуя вариационный ряд. Учитывая встречаемость отдельных вариант, или средних значений классов, составляют вариационные кривые. При этом по оси Х откладывают значения вариант, а по оси У – частоту их встречаемости. Установлено, что вариационная кривая имеет вид перевернутой параболы.

Значение: обеспечивает приспособленность организма к изменяющимся условиям существования, что способствует выживаемости организмов, а значит их успеху в эволюции в целом.

Комбинативная изменчивость – не связана с изменениями генов, а только с их перекомбинацией у потомков. Реализуется в ходе полового размножения.

2) независимое расхождение гомологичных хромосом в анафазу I мейоза, имеющее место при образовании гамет;

3) явление случайного оплодотворения.

1) способствует увеличению генетического разнообразия потомства;

2) лежит в основе гибридологического метода в генетике и селекции, позволяет получать организмы с необходимыми человеку комбинациями признаков.

Мутационная изменчивость – вызывается мутациями – непредсказуемыми скачкообразными изменениями генотипа (а именно: генома, хромосом или генов).

1. Наследуется, так как затрагивает генотип.

2. Носит индивидуальный характер.

3. Непредсказуема – невозможно предвидеть какие изменения возникнут на действие фактора.

4. Ненаправлена – изменения не носят приспособительный характер.

1. По изменению генотипа: генные, хромосомные, геномные.

2. По влиянию на жизнеспособность: летальные, полулетальные, нейтральные.

3. По поведению в гетерозиготе: доминантные и рецессивные.

4. По отношению к генеративному пути: соматические (возникают в обычных клетках тела и ненаследуются) и генеративные (в половых клетках, поэтому наследуются).

5. По локализациив клетке: ядерные (в ДНК ядра) и цитоплазматические (в ДНК митохондрий и пластид).

6. По причине, вызывающей мутацию: спонтанные (причина не ясна) и индуцированные (вызываются мутагенами).

Мутагены – факторы среды, вызывающие мутацию. По природе мутагены бывают:

— физические (рентгеновское излучение);

— химические (асбест, формалин);

— биологические (ДНК вирусов).

Геномные мутации – связаны с изменением числа хромосом в геноме – гаплоидном наборе хромосом.

Различают 2 вида:

1. Полиплоидия (эуплоидия) — изменение числа хромосом, кратное гаплоидному набору. Различают автополиплоидию и аллополиплоидию.

а) При автополиплоидии многократно повторяется один и тот же хромосомный набор. Например, существуют виды хризантем, содержащие 18 хромосом (2n), 27 хромосом (3n), 36 хромосом (4n) … 81 хромосому (9n).

б) при аллополиплоидии многократно повторяются разные хромосомные наборы. Например, пшеница мягкая — гексаплоид, который содержит хромосомные наборы от 6 разных видов пшениц. Аллоплоидия в природе встречается редко, возникает при межвидовой гибридизации, чтобы гибриды смогли дать потомство необходима полиплоидизация. Так, селекционером Г.Д. Карпеченко был получен плодовитый гибрид капусты и редьки.

2. Гетероплоидия (анэуплоидия) — изменение числа хромосом, некратное гаплоидному набору. В результате возникают явления:

— трисомии (2n+1) — трисомия по 21 паре хромосом — синдром Дауна

— моносомии (2n-1) – моносомия по половым хромосомам – синдром Шерешевского-Тернера;

Гетероплоидия обычно сопровождается серьезными наследственными аномалиями, часто несовместимыми с жизнью.

Хромосомные мутации — изменения структуры хромосом. Различают внутри- и межхромосомные аберрации (приведена классификация АА. Сазанова).

1. Делеция – утрата участка хромосомы.

2. Дефишенси – концевая делеция.

3. Дупликация – удвоение участка хромосомы.

4. Амплификация – многократное повторение участка хромосомы.

5. Инсерция – вставка дополнительного хромосомного района.

6. Парацентрическая инверсия – поворот на 180° участка хромосомы, не содержащего центромеру;

7. Перицентрическая инверсия – поворот на 180° участка хромосомы, содержащего центромеру.

1. Транслокация – перенос участка с одной хромосомы на другую;

2. Реципрокная транслокация – обмен участками между негомологичными хромосомами;

3. Робертсоновская транслокация – слияние двух акроцентрических хромосом с образованием одной субметацентрической хромосомы.

Генные мутации — связаны с изменением последовательности нуклеотидов в гене.

Различают 2 механизма:

1. Связан с изменением числа нуклеотидов (дупликации, делеции). В связи с тем, что генетический код не имеет знаков препинания, меняется состав всех кодирующих триплетов после места мутации, что приводит к замене многих аминокислот и синтезу белка с совершенно другими свойствами, что может оказаться губительно для организма.

2. Связан с заменой одного нуклеотида на другой. При этом меняется состав только одного триплета, что может привести к изменению только одной аминокислоты в белке (и то не всегда, так как генетический код вырожден). Замена 1 аминокислоты не всегда существенно сказывается на изменении свойств белка (особенно, если она по свойствам близка к исходной).

Генные мутации играют большую роль для эволюции. Они, по мнению С.С. Четверикова, создают резерв наследственной изменчивости. Так как большинство мутаций рецессивны, то в гетерозиготном состоянии могут долгое время себя не проявлять. Это очень важно, так как при изменении условий среды, выщепившаяся мутация может оказаться полезной и спасти вид от вымирания.

Отрасль генетики, изучающая генофонд популяции. Для изучения встречаемости отдельных генов и генотипов в популяции используют закон Харди-Вайнберга.

Закон Харди-Вайнберга был создан для идеальной популяции.

Черты идеальной популяции:

1. Популяция, характеризующаяся панмиксией – ничем не ограниченным свободным скрещиванием особей.

2. Популяция, на которую не действуют факторы эволюции, такие как естественный отбор, популяционные волны, дрейф генов.

3. Популяция, имеющая огромную численность.

Однако было установлено, что закон может быть с определенной долей условности применим для расчета доли определенных генов и генотипов и в реальной популяции.

Пусть p – частота гена А, тогда q – частота гена а.

(p(А)+q(а)) 2 = p 2 (АА)+2 pq(Аа) +q 2 (аа)

Скрестили 60% особей с генотипом АА и 40% особей с генотипом аа. Определите вероятность генотипов АА, Аа и аа после установления в популяции динамического равновесия.

Из условия задачи делаем вывод, что p=0,6, а q=0,4. Тогда

Частота генотипа АА (p 2 )= 0,6 2 =0,36

Частота генотипа Аа (2 pq)= 2х0,6х0,4=0,48

Частота генотипа аа (q 2 )=0,4 2 =0,16

Интересные вопросы по генетике

1. В каких структурно-функциональных состояниях и где (в каких организмах, структурах) находится функционирующая или сохраняющая способность к функционированию ДНК?

Функционирующая или сохраняющая способность к функционированию («живая») ДНК может находиться:

· в составе эухроматина клеточного ядра в интерфазе жизненного цикла клетки; ДНК, образующая эухроматин, является активной, участвующей в транскрипции;

· в составе гетерохроматина, который, в отличие от локализованного в центре ядра эухроматина, располагается по периферии клеточного ядра; образующая гетерохроматин ДНК функционально неактивна, т.е. не участвует в транскрипции;

· в виде кольцевой молекулы ДНК клеточных органоидовмитохондрий и пластид; эта ДНК, кодирующая преимущественно структурные белки органоидов, обычно является всегда активной;

· в виде кольцевой молекулы ДНК прокариотической клетки; локализованная непосредственно в цитоплазме, эта ДНК функционирует непрерывно;

· в составе хроматид (дочерних хромосом) в период митоза: отличаясь высшей степенью спирализации и связи с упаковочными белками-гистонами, эта ДНК является неактивной;

· в составе многих вирусов, образуя их наследственный аппарат, окруженный белковым чехлом (капсидом); вирусная ДНК переходит в активное состояние только внутри клетки организма – хозяина;

· в виде плазмид, которые устроены еще проще, чем вирусы: представляют собой лишенные какого-либо окружения («обнаженные») молекулы или фрагменты молекул ДНК; они локализуются в клетке бактерий, где могут либо соединяться с кольцевой молекулой ДНК, либо оставаться непосредственно в цитоплазме; плазмидная ДНК является активно функционирующей ДНК, придающей прокариотической клетке дополнительные наследственные свойства: например, пеницилиназная плазмида (R-фактор или фактор устойчивости) обеспечивает устойчивость стафилококков к пенициллину.

2. Какой район рассматривался академиком Н.И.Вавиловым в качестве «центра происхождения культурных растений»?

В качестве «центра происхождения культурных растений» Н.И.Вавиловым рассматривался район, в котором обнаруживалось наибольшее генетическое разнообразие представителей данного вида растений. Н.И.Вавилов выделил 7 центров происхождения культурных растений:

· южно-азиатский (рис, цитрусовые, сахарный тростник);

· восточно-азиатский или китайский (соя, просо, гречиха);

· юго-западноазиатский (пшеница, рожь, бобовые, виноград, плодовые культуры);

· средиземноморский (капуста, маслины);

· абиссинский (ячмень, кофейное дерево);

· центральноамериканский (хлопок, кукуруза, фасоль, какао);

· южноамериканский (картофель, хинное дерево).

В качестве древнейшего среди них он рассматривал абиссинский центр. Впоследствии число центров происхождения культурных растений было увеличено до 12.

| следующая лекция ==>
Законы наследственности Г. Менделя | Схемы восстановления вычислительного процесса

Дата добавления: 2019-11-25 ; просмотров: 478 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Плазмидное наследование

?ЛШНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК имени И. И. МЕЧНИКОВА

На правах рукописи УДК 579.61.083.1:616—089—001.4—022.7—078 МЕНЬШИКОВ Дмитрий Дмитриевич

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИНЦИПОВ ДИАГНОСТИКИ, ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ РАНЕВОЙ ИНФЕКЦИИ В ЭКСТРЕННОЙ ХИРУРГИИ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Работа выполнена в Московском городском ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте скорой помощи имени Н. В. Склифосовского.

Официальные оппоненты — доктор медицинских наук

доктор медицинских наук, профессор И. П. Фомина,

доктор медицинских наук, профессор Л. М. Недвецкая.

Ведущее учреждение, дающее отзыв о ?научно-практической значимости работы Центральный институт усовершенствования врачей.

Защита состоится « . . ». 1988 г.

в . час. на заседании специализированного совета

(Д 074.22.01) при Центральном научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова Минздрава СССР по адресу: 103064, Москва, пер. Мечникова, дом 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центрального научио-исследовательского института вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова Минздрава СССР.

Автореферат разослан « . . ». 1988 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук Н. Г. КУДРЯВЦЕВА.

Л-39690 23/11-88 г. Объем 2 п. л. Зак. 245 Тир. 100

Типография Московского лесотехнического института

ОБЩАЯ ?А?АлТЕ?ИСТЛКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В стационарах хирургического профиля в последние десятилетия отмечают увеличение количества больных с гнойно-воспалительными заболеваниями и осложнениями, почта половину которых составляют нагноения ран (В.Д.Беляков с соавт., 1975; М.Н.Кузин, Б.М.Костаче^ок, IS8I; J.Alb-rocht , I?62 ; Н. J.tj.Ooetvogel, J.M.V.Vroonhoven , 1984). Особенно велика социальная и экономическая значимость внутри-больничных инфекций, на борьбу с которыми, например, в США, ежегодно расходуется более миллиарда долларов ( p.n.Daeohner« 1964). ‘

Смотрите еще:  ВС подготовил обзор судебной практики по делам, связанным с третейским разбирательством. Налог с третейского судьи

В настоящее время- гнойно-воспалительные заболевания и осложнения занимают веющее место в инфекционной патологии человека. Позтсглу изучению возбудителей нагноений уделяют большое внимание. Опубликовано много работ об изменения этлологачиской структуры и лекарственной чувствительности условно-патогенных микроорганизмов при гнойной инфекции под влиянием ряда факторов, среди которых основными являются стратегия и тактика использования антибиотиков (А.К.Акатов, В.С.Зуева, 1983; А.3.

С моля некая, IS86; O.Pulverer . I-61; О. R. Magnus a en, Ы.Т. Jacobs« ISB4 ; G.Kegels, J.M.Lamotte, 1986).

Ежегодно в лечебно-про^язактических учреждениях страны производят- хирургические вмешательства миллионам больных с неотложными еостсяшикя, однако исследоваягя, направленные на усовершенствование диагностик:, профилактики и лечения panes oS иа^екца» ‘з окотоенвой лздупгп», дока кемнэгечиеяеяка. 3 литере.-туре лризодат кротиворечивкз даинкч о дв^гцеЯ роли в

возникновении раневой инфекции «уличных» и «госпитальных» штаммов микроорганизмов. ,До настоящего времени не изучали общие закономерности и специфические особенности в изменениях чидового состава и лекарственной чувствительности микрофлоры гнойных рал больных в условиях стационара скорой медицинской помощи (ССМП). Отсутствуют сведения о видовом составе, фаго-сероварах и чувствительности к антибиоткам возбудителей ранево! инфекции у больных с экстренной хирургической патологией.

Некоторые исследования указывают на необходимость экологического подхода к изучению инфекционных, в том числе и гнойно-воспалительных, заболеваний (В .Л.Контримавичус, 15382; В.Ю. Ли.твин, IS83;ir.semina . 1084). Целесообразность такого подхода подтверждают случаи восстановления лекарственной чувствительности «госпитальйых» штаммов бактерий при ограничении использования в стационарах тех или иных антибиотиков ( J.E.Devi-оо , 1981; tt. .Tichape, Н. Rlsahe , 1982). Однако экология возбудителей гнойной инфекциг в условиях ССМП не изучена.

Не разработан комплекс экспресс-методов быктернологичео-кой диагностики, позволяющий контролировать эффективность антибактериальной терапии больных,. До настоящего времени не определены принципы профилактики и лечения раневой инфекции, вызванной аятибиотикорезистелтными микроогранизмами к их ассоциациями. Отсутствуют сведения о возможности и целесообразности «проведения мониторинга возбудителей нагноений в условиях ССМП и использования экологических показателей дая оценки взаимодействия в системе паразит-хозяин при раневой инфекции.

Таким образом, об актуальности работы свидетельствуют: распространенность раневоЛ инфекции и недостаточная изученное« акологлк возбудителей нагноений ран, значения «госпитальных»

иташов микроорганизмов в возникновении осложнений,’ лекарственной чувствительности и характера симбиотических взаимоотношений смешанных популяций бактерий в гнойных ранах в условиях ССМП.

Целыо исследования является разработка экологически обоснованных принципов бактериологической диагностики раневой инфекции и получение микробиологических данных для усовершенствования комплексной профилактики и лечения нагноений ран з экстренной хкрургип.

Цель исследования определила необходимость выполнения следующих задач:

1. Разработать комплекс методов бактериологической диагностики раневой инфекции, учитывающий взаимодействие микроорганизмов в скапанных популяциях и состояние внутренней сре-лн организма больного.

2. Провести ретроспективный анализ частоты выделения возбудителей раневой инфекции, выделенных от больных за многолетний период, изучить лекарственную чувствительность микрофлоры гнойных ран и оценить целесообразность регулярного

слежения за составом и антибиотикорезистентностью возбудите. *

лей раневой инфекции при неотложных хирургических заболеваниях и трав НЕ».

3. Па основании использования экологических показателей, дашшх бактериологического и им.\ bi cxcv.a ди^еренццацпа стафилококков. l:;:svacoTa:: елгеоб лабораторной оценки ¦•’ект:;^:!сстл кекг-‘лгке-ко:’. а;1.тот:Пт::> 6cji тих с рансво;! йн1скцие;;.

мя оишшьной организации пробила,:тики и лечения гноляо-всспйяителышх осяьхнвипй и -заболеваний необходимы сведения о составе возбудителей. При обобщении результатов поьсоднеишх бактериологических исследований установлено, что в условиях С;;,/Л яри нагноения из ран наиболее часто выделяют представ-излей семейства Micrococcaceae . г. основном a.aureue (рш:. 2).

Рис, 2. Удельный вео (в основных возбудителей раненой шиекгигл яо ес х подразделениях (ХШ за двухлетний период

??раьеден анализ частой’, ^иделешда представителей отдельных cewr.ctz: среди 15 2J3 гаме бактерий, полученных при иик-робвояэглчзвкон ксаяедойеяяи катерьшга из гяoIhux пан больных 1-раь:.аталох»2чеокот, хирургического отдг;леп:гк и клиника острых тчгкгк’мскп? поражен;.

ii учение- дкяамвг* неструктура псз-Зу «:?лдеЗ (рас. 3,о) коуюлряо чотчопикь снуют к 3miww!>womj’ умениен:;« 3:

1Ло;;сккол : -лее чем 25$ -изучаемых штаммов.

От больных хирургического и травматологического отделений в течение четырех кварталов 1976 г. с наибольшей че-тотоХ

выделен серологический вариант 026 :К4, вероятно, циркуляру »-игай в этих подразделениях с высоким постоянством. Чап;е других обнаружены еще три сероваоа.

В целом данные, полученные при изучении родового, видового состава, ких взаимоотношениях между золотистым стафилококком и евяегнойнол палочкой (табл. 3), которая в ранах больных с травма.*«! характеризуемся показателями 6,4 и 8,5%. При термических пордоэетшх коэ?-фициеи* Таккарда дия этих мадроэргааздмос значительно -.> • к додаигает 21,4’Х, что свидетельствует о6 иэкетгиш ау. ¦

отнообнай бшсто^чй в о.зоговых ранах. Выявлена общность протеев к энтерококков, достигающая 22,1%, «тот показатель в данных наблюдениях был наивысшим.

Экологическая общность (в возбудителей раневой инфекции в разных клиниках

Микроорганизмы К .л и н и к и **

травматология опорно-двигательного аппарата (я =372) сочетанной ц множественной тоанмы (а =651) тсомических поражений (г. =1005)

Зол о тистый С ТйфИЛ 0 KOKK+ синегноЯноя палочка 6,4 8,5 21,4

Эпидермальний отафило-кокк + скнегно^ная палочка 1,9 2,5 эд

Протеи + энтерококк О О О 22,0 29,1

Протеи + коринебактеряи ¦ 4.7 6.1 . 0

Пиогсннвй стоеатококк + золотистый стафилококк . .7,7 5,8 14,0.

Коринебактерии + 3 ол uтле тый с тофяяскокк 9,» 8,3 13.4

В ранах отдел-них обследованных в .динамике больных с’ тяжелим задавший течением заболеванпя показатель экологической общности микроорганизмов, например, золотистого стафилококка с олпегкэйной папочкой или с протеем достигает 00

100. 3 эгоиарпкаие in vivo ‘ , празедеяиом для вьяогзнкя ‘ яричяи изкзнзнхл коэффициента .\вкк:года, уоздяоплеио, что Jsk-tcdom, уьел т-нглгдатм опособн чть бяктерлй к совд:естисч*у сосу-

еесгвованш является недостаточно эффективная антабиомкоте-рапия. В случаях ее недостаточной эффективности уменьшается антагонистическое влияние псевдомонад на стафилококки, которые по сравнений о нелеченными кивотныш присутствуют в большей чрсти ран , и показатель экологической общности этих бактерий увеличивается более чем в три раза — о 22,2$ до 74,3/5 (Р

п оолзе •?.¦-стое по

учан»е сис-деяяа. Учитывал это, а такчее

сбъзм ::н»oprsiun, е.. ::’:сна кл^роб^пхы,: ¦

Эффективность антибактериальной дерашш ранелой . j во кнэгом ‘зависит от сроков се начата, [‘анее :.» назначение . i-тибиотиков требует наличия информации о лекаретьешюл чувес-.>-тельности возбудителей, Приведенные вше данные свкдательси /ют о том, что в услозкях ССЫЯ сразу при выявлении раневой Фекцик «ожно назначать больным антибактериальную терапию ц: основании данных регулярного слелсенля за составом и лекарей-.я но»: чувствительность» возбудитеяеЕ, выделенных из гнойных ?-..и больных ь различных подразделениях. Незначительная pucupcci..^.-ценность устойчивости бак^ориП к отдельным дохкбяотак&л пси • ляет считать, что надежность такого назначенца достигнет ВО/’ к Солее.

,.1ри выборе антибактериальных препаратов в зависимости о-,: этапа бактериологи ;еокого обследоващи больного целесообразн’. использовать различную информацию (табл. 5).

Дчя выявления этапов шфя&рованкп ран проведено их бактериологическое • обследование в процессе пребывания больных ь стационаре. ^Изучение в дштшке юмробной обсемененноети ран i раневого отделяемого 114 больных, прооперированных в экстренно;-порядке по поводу «чистых» и «условно чистых» вмешательств, п«с болило выявить условно-патогенные шкрооргшшзш в йй, S1 основной — применяли всгшрациокяыЁ (по Редору) кг год Про’ГЛЯктКИ, п В’О 2-i: ОСНОТ:НОГ. — аОНКраЦИОННО-ППОГ.’Ы8ПО.

У станот’леио, что при цгпррщйпкнои методе ярофяягкедкя в duhovo;., гскрете и«. гвдвыг суток кг^.о^гге« В ©рг<Н«м o.-v.T

зсловно-патогеннаи ск.А-»в?вй. М вторые ауои ил ‘ш>хткзст значительно возрастала,. доотитея. 1,7*10? КОЯ/мя» При-ветой зт-г« го является закупорка дренажа сгустком крови, кусочкам клетчатки и т.д., приводит к эасто» раневого- отделяемого. Пря аспярадаонно-прсмшяшл способа- предупрвздекля нагноений уро» взиь контаминации раневого отделяемого в> вервие- трое суток послеоперационного вериода постоянен я¦ соота-влиег около 105 КОЕ/мл. Иэ 45 человек этой групп», абсладозаннйх количест-вепкнма методами э дияаиике-,, у 17 (37г8/Г> сбсеменяемость ро» достигала 10^ КОЕ/т п бтея уалозн-ф-ааяогеитх бактеряп, однако клинические признака рааяве» ?шфежцш отсутствовали, В коптраатной группе из 68 больных раневая инфектя- развилась у 8 (11,6%), яри аспирадзощюм’по; Редану оястзск5е профашстгкЕГ из 86 человек нагноетЕ» ра» возшат у 6 <7%>, а при асгшращх-онно-промыйном из 80 ладаенюэ1 — только у 2 (??ГЬ%),

Таким образом, пря есгароционно-аромвтом ммадз профилактики по сравнений с комтраатггой грушой1 отмочено значительное снижение количества нагноений ран (в 5 раз). Зто позволяет считать» Что .’лечение,, Изменяющее замкнутость раны, полок;-тельно влияет па течение раневого процесса. Следует отметите.. что при аопарационных способах профилактики в течение суток о отделяемым, й промывной жидкостью из раны удаляется до Ш*^ клеток жизнеспособных бактерий.

Таким образом, проведенные в динамике пребывания бошмх в стационаре иооледования, позволили установить частое пп&:г» -рование ран штаммами микроорганизмов на всзх этапах лечения. Показана эффективность аспирационных методов лечения ран.

Однако при обследовании больных не удалось получить сидений о целесообразности проведения химиотерапии да про’ж->.» тпки ракевоИ ян$екцза, вызванной саедаяшт .тсзуляжта’«

Чистота возникновения осложнений у больных с ранами, обсемененными и необоемекеннша микроорганизмами (в %)

срсфалактики рационная .контаминация ран

Осложнения раневого процеоса Гнойные Негнойные Воего

грдша ные 42 16,7+5,8 14,3±5,5 31,0-7,2 неинфициро-

ианные 26 3,9+3,9 3,9+3,9 7,7+5,3

лспи^зцисн- инфицированный ‘ ные 60 10,0*3,9 8,3+3,6 18,3+5,0

кй-проаывной над 63 3,1+2,2 6,9+3,1 3,5+3,7

Згзтикоре знстентных микроорганизмов. Учитывая, что подсбнао даннш с этической и методологической точек зрения иевозыоак-, яодучя» при наблюдении за больными, наш проведеия опыту la rAtro и серия экспериментов на крысах линия wiotwr . Создааа*« А’лппую модель,, мы далеки от попыток механистически перенести полученные данные в клинику, но предполагаем, что полученнио jegjjiwraiH позволят расширить и углубить поникание процессов, адодоусодящих в гнойных ранах больных.

В 66 опытах in vitro выявлена большая устойчивость к антибактериальным препаратам микроорганизмов в смешанных по пулядаяу:до сравнению с чувствительностью иококультур зтих so йактерй. ;Так, 8 штаммов золотистого стафилококка на плотных ераддх чувствительны к 0,17’акг/мл задав, а при совместном

.’.»-теи бактериоскопии гноя а использования наряду с ебкчяыкл. 😕 къ* • ни,и к .вдкикз штйтзлыиа» средами повл;?; срел.

3. Разработана модификация б акте риостатиче с ко й пробы, позволяющая изучать антибактериальную активность сыворотка крови больного по отношению к аутощташам возбудителей нагнс кий и тлучгть данные об эффект;’анос та котлексного лечения. Постановка пробы позволила у 14,6? больных провести коррекция ?нтибаотикс-ерапии.

4. Антигенемия и .ангителообразование у больных со сме-иштит инфекциями зависят от вида шкпоба-ассоциаита. При н гноениях, вызванных ассоциациями, содержащими золотистый ста Фшюкокк, протеи и синевнойную палочку они менее выражены, чом ври мононнфекциях.

; о, При усовершенствовании профилактики и лечения нагноений ран у больных с экстренной хирургической патологией и травмами следует учитывать, что наиболее часто раневую ш-фекнию вызывает золотистый стафилококк и синегношаа палочка, доля которых соотавлеет соответственно 30,5% и 19, дХ от всех выделенных из гнойных ран штаммов возбудителей. Установлена величина спонтанных колебаний удельного веса представителей основных возбудителей раневой инфекции в различные годы и сезоны, ‘выявлена тенденция к увеличению доли стафилококков при травмах опорно-двигательного аядапата и ои-негнойной палочки при нагноении ран после экстренных хирургических вмешательств и при термических поражениях, ifi. Использование показалеля постоянства возбудителей дает информацию об этиологической роли микроорганизмов при Смешанных инфекциях. Изучение с помощью коэффициента Жаккарда &везса,а«вской обвдости возбудителей нагноений позволило уста-

повить, что у Меньшиков, Дмитрий Дмитриевич

  • доктора медицинских наук
  • Москва, 1988
  • ВАК 03.00.07
  • Презентация: Получение продуцентов с помощью генной инженерии

    Первый слайд презентации: Получение продуцентов с помощью генной инженерии

    Генная инженерия, или техника рекомбинантных ДНК, — это совокупность приемов, позволяющих in vitro перенести генетический материал из одного организма (источника генов) в другой (реципиент) так, чтобы обеспечить наследование этих генов в новом для них организме. Одной из главных задач генной инженерии является получение организмов с желаемыми свойствами. 1. Сущность и задачи генной инженерии.

    Смотрите еще:  Трасологическая экспертиза в Нижнем Новгороде. Трасологическая экспертиза вопросы при дтп

    Методами генной инженерии возможно преодолевать межвидовые барьеры, то есть переносить гены и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим (напр., от человека или животного — бактериям, растениям и др.). Генетически модифицированные микроорганизмы ( трансгенные или рекомбинантные ), обладающие сверхпродукцией получены для производства инсулина, соматотропина, интерферона и многих других белков. 1. Сущность и задачи генной инженерии.

    I выделение нужного (целевого) гена; II встраивание гена в генетический элемент, способный к репликации (вектор); III введение вектора в организм-реципиент; VI идентификация (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены. I Выделение нужного (целевого) гена – один из главных этапов в генетической инженерии. Существует два основных способа получения гена: синтез и выделение из ДНК. 2. Этапы получения генетически модифицированных микр –продуцентов

    Слайд 5: Схема основных этапов генетической инженерии

    А. Химико-ферментативный синтез генов применяют наиболее часто. Химическим путем синтез олигонуклеотиды или праймеры (короткие одноцепочечные фрагменты ДНК — 8-16 нуклеотидов), а гены синтезируют ферментативным методом с помощью ПЦР. ?.1)Синтез гена осуществляется 2-мя путями

    Б. Синтез генов с помощью обратной транскрипции на мРНК. Выделяют мРНК соответствующего гена из полирибосом и используют ее в качестве матрицы для фермента ревертазы. Метод основан на универсальной способности обратных транскриптаз синтезировать двунитевую ДНК ( кДНК ) на однонитевых РНК-матрицах. ?.1)Синтез гена осуществляется 2-мя путями

    Гены также могут быть получены из уже созданных геномных библиотек, которые представляют собой совокупность фрагментов геномной ДНК какого-либо организма или из библиотек кДНК. ?.1)Синтез гена осуществляется 2-мя путями

    Необходимо точно знать расположение гена и вырезать его при помощи рестриктаз. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри сайта, либо в непосредственной близости от него. ?. 2) Выделение гена из ДНК клетки с нужными свойствами.

    Выделенный или синтезированный ген не может самостоятельно встраиваться в ДНК клетки-мишени и тем более начинать функционировать. Для переноса целевого гена создают специальную конструкцию — вектор, несущий полученный ген и способный встраиваться в геном клетки. II Встраивание гена в генетический элемент, способный к репликации (вектор).

    вектор должен быть небольшим и содержать сайты рестрикции для нескольких рестриктаз, должен обладать определенной емкостью ; вектор должен иметь точку начала репликации ( ori ), т.е. автономно реплицироваться, накапливаться в многочисленных копиях в клетке хозяина и сохраняться в дочерних клетках при делении материнской; II 1. Требования к генетическим векторам:

    иметь функциональный ген промотор ( прокариотический или эукариотический ), способный экспрессироваться в клетке; — должен иметь маркерный ген, позволяющий различать гибридные клетки для эффективной селекции ; — должен быть способным передаваться в клетку соответствующего организма. II 1. Требования к генетическим векторам:

    Генетическая карта плазмиды pBR322. Одна из наиболее часто употребляемых плазмид для клонирования. pBR322 создана на основе плазмид природного происхождения, выде- ленных из E. coli. Эта плазмида несет гены устойчивости к двум антибиотикам: ампициллину (ген a mp ) и тетрациклину (ген tet ), а также уникальные сайты для Bam HI, Hind III и Sa l I в генеТеt

    Маркерные гены флуоресценции у генномодифицированного растения

    Маркерные гены флуоресценции у генномодифицированных мышей

    В качестве прокариотических векторов чаще используют плазмиды бактерий, бактериофаги. Плазмиды бактерий способны реплицироваться независимо от хромосомы это их главное свойство. Плазмиды могут быть выделены из клетки и использованы в неповрежденном, нативном состоянии. В векторной плазмиде E.coli pBR322 есть маркерные гены устойчивости к ампициллину и к тетрациклину. II 2. Характеристика векторов для переноса генетической информации в прокариотические клетки.

    Бактериальные клетки, содержащие такой вектор, устойчивы одновременно к ампициллину и тетрациклину. Плазмидные векторы удобны для клонирования небольших фрагментов (до 10 тыс. пар оснований) геномов, т.е. плазмидные векторы обладают небольшой емкостью. II 2. Характеристика векторов для переноса генетической информации в прокариотические клетки.

    Бактериофаги – вирусы бактерий способны встраиваться в геном клетки хозяина (вызывать лизогенизацию ). Бактериофаги широко распространены в природе — их выделяют из воды, почвы, организмов различных животных и человека. Большинство фагов ДНК-содержащие вирусы, имеют смешанный тип симметрии капсида. Широко используют векторы на основе бактериофагов E.coli — ? и М13. II 2. Характеристика векторов для переноса генетической информации в прокариотические клетки.

    Из ДНК фага удаляют области, не существенные для репликации в клетках E.coli, и оставляют сайты, предназначенные для проникновения и встраивания фага в геном клетки хозяина (фаговый вектор должен проникнуть в клетку и встроиться в геном). В эту же область встраивают целевой и маркерные гены. На основе бактериофага ? можно сконструировать векторы емкостью до 25 т.п.н. II 2. Характеристика векторов для переноса генетической информации в прокариотические клетки.

    Схема создания векторной конструкции использованием фага

    В качестве эукариотических векторов используют вирусы животных и растений, Ti плазмиды агробактерий ( Agrobakterium tumefaciens ), а также искусственно сконструированные векторы, способные реплицироваться как в бактериальных, так и в эукариотических клетках (челночные векторы). II 3. Характеристика векторов для переноса генетической информации в эукариотические клетки.

    Очищенную кольцевую плазмиду E.coli pBR322 обрабатывают ферментом рестриктазой Bam H1, которая специфически разрезает плазмиду в единственном сайте, расположенном в гене устойчивости к тетрациклину, так что образуется линейная молекула с липкими концами. Такие молекулы смешивают с подготовленным участком ДНК (с нужным геном), содержащим комплементарные липкие концы. II 4. Создание генетической конструкции.

    Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими последовательности.

    а) схема действия фермента рестриктазы Eco RI на двухцеп мол ДНК, с указанием участка распознавания и места разреза; б) фрагменты ДНК с липкими концами после разрезания ферментом Eco RI. Возможно расщ-е ДНК со сдвигом, при этом одна из нитей выступает на несколько нуклеотидов. « Липкие » концы в силу своей комплементарности вступают во взаимодействие. Выделение генов из ДНК проводят с помощью рестриктаз

    Схема получения рекомбинантной ДНК по Коену -Бойеру

    Поскольку липкие концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они спариваются с образованием гибридных молекул. Далее смесь обрабатывают ДНК-лигазой для сшивания комплементарных концов нужного гена и вектора. II 4. Создание генетической конструкции.

    При включении фрагментов ДНК в участок гена резистентности к тетрациклину, устойчивость к тетрациклину из-за этой вставки нарушается, и все рекомбинантные плазмиды сохраняют устойчивость только к ампициллину. Таким образом, высевая клетки на среды с антибиотиками, можно отобрать клоны, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК. II 4. Создание генетической конструкции.

    Введение гена в плазмиду E. coli и клонирование рекомбинантной ДНК в клетках.

    Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться в ее ге­ном (интегрироваться в хромосому) и реплицироваться за ее счет (как лизогенные бактериофаги), либо быть способной к автономной репликации (как плазмиды). III Введение вектора в организм-реципиент.

    Для введения вектора делают клетки компетентными путем обработки хлористым кальцием, полиэтиленгликолем, тепловым ударом или лизоцимом, после чего добавляют к ним векторные конструкции. Векторы в бактериальные, грибные, растительные или животные клетки вводят разными путями, в том числе естественными способами, которые широко распространены природе: III Введение вектора в организм-реципиент.

    В эту же область встраивают маркерные гены, для отличия рекомбинантной ДНК от исходного вектора. Ёмкость бактериофага ? до 25 т.п.н. III Введение вектора в организм-реципиент. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетичес кого аппарата клетки, она должна либо встроиться в ее геном (интегрироваться в хромосому) и реплицироваться за ее счет (как лизогенные бактериофаги), либо быть способной к автономной репликации (как плазмиды ).

    а) конъюгация – генетический материал клеток при сближении переходит из одной клетки в другую в виде плазмиды; б) трансдукция – передача клетке генетического материала через вирус (эукариотических клеток) или фаг; в) трансформация – это проникновение фрагментов нативной ДНК через оболочку клетки. III Введение вектора в организм-реципиент.

    осуществляют уже после клонирования в клетках E. coli. Сначала клетки после трансформации высевают на питательную среду, содержащую ампициллин, так как трансформированные и нетрансформированные клетки устойчивы к ампициллину (это позволяет выявить клетки как с «пустым» вектором, так и со «вставкой»). VI Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены

    На втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки, выросшие на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрациклином методом перепечатки (делают пересев с точным расположением колоний на среде). Клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину, поэтому не будут расти на среде с тетрациклином. VI Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены

    Сначала клетки после трансформации высевают на питательную среду, содержащую ампициллин. В таких условиях могут вырасти только те клетки, в которых присутствует интактный ген bla — или в составе интактной плазмиды pBR322, или в составе гибридной плазмиды ; нетрансформированные клетки чувствительны к ампициллину. Сайт BamHI расположен в гене tet плазмиды pBR322, встраивание в этот ген фрагмента ДНК прерывает кодирующую последовательность, и устойчивость к тетрациклину утрачивается. Т. о., кл, несущие гибридную плазмиду, устойч к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину, а клетки, получившие интактную плазмиду pBR322, несут ген tet и устойчивы как к ампициллину, так и к тетрациклину. На втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки, выросшие на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрациклином методом перепечатки. Идентификация и отбор клеток, которые приобрели нужный ген

    Ti-плазмиды ( Tumor inducing ? – индукция новообразований) агробактерии, которая в естественных условиях вызывает у растений образование опухолей (корончатых галлов) в местах проникновения бактерии корончатый галл Галлообразование на морковном ломтике привитом Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens

    Генетическая колонизация растения Agrobacterium tumefaciens 1- агробактерии существуют в ризосфере; 2 — строение A. tumefaciens ; 3 – встраивание Т-ДНК в геном; 4 – образование опухоли

    В состав Тi-плазмиды входят участок, встраивающийся в геном растения (Т-ДНК- область), гены ? vir — области, обеспечивающие перенос Т-ДНК в растительный геном, а также гены синтеза фитогормонов ( ауксинов и цито-кининов ) и опинов (производных аминокислот). http://www.biotechnolog.ru/ge/ge12_4_2.png

    Т. о., кроме Т-ДНК в плазмидах имеются область, кодирующая функцию конъюгации ( Tra ), область репликации ( Ori V) и область вирулентности ( Vir ). Важно отметить, что все гены, ответственные за перенос и интеграцию генов Т-области, находятся не в ней самой, а рядом — в области вирулентности—vir-области. Т-области ограничены прямыми повторяющи — мися последовательностями по 24—25 п. н., и любая ДНК, вставленная между этими повторами, будет принята за Т-область и перенесена в растительную клетку.

    Последний слайд презентации

    Создание коинтегративного вектора на основе Тi-плазмиды : Рр — расщепление рестриктазой В результате этого Т-ДНК со встроенным геном включается в нативную Ti- плазмиду, замещая нормальную ДНК. Получаются клетки А. tumefaciens, несущие Ti-плазмиды со встроенными в Т-сегмент нужными генами. Далее их перенос в кл растения осуществляется обычным способом, характерным для агробактерий.